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单抗生产中的发酵液澄清工艺

抗体治疗方式被认为是目前最为流行的重组蛋白治疗方式。抗体可以在细胞培养液中以可溶和较为稳定地形式被高水平地表达。使用哺乳动物细胞表达均一的人源化抗体已经被广泛应用,而细胞的去除和发酵液澄清对于后续工艺的开发具有非常重要的意义。

典型的发酵液澄清工艺

哺乳动物的培养细胞很容易受到剪切力的影响,容易破碎从而释放出蛋白酶和其他的宿主细胞蛋白,从而影响抗体的稳定性和纯度。此外,由于细胞培养基营养丰富,很容易染菌,从而造成蛋白和工艺设施的污染,所以处理时间对于细胞的去除和澄清也非常重要。离心和切向流过滤常被应用于工业中去除细胞,最近几年深层过滤的应用也越来越广泛。絮凝剂有时也被用来增强细胞去除和离心的效果。除菌过滤一般用作色谱柱之前细胞去除和澄清的最后一步。当前细胞去除和发酵液澄清的主要工艺结构如图1所示。

图1  大规模动物细胞发酵液的常见澄清工艺

第一级深层过滤,第二级深层过滤、除菌过滤

离心

工业上大多应用Disk-stack离心去除细胞及其碎片。Disk-Stack离心可以连续离心,提高处理量,缩短处理时间。图2为Disk-stack离心机的结构。

在离心工艺开发过程中,有很多参数需要优化,如补料的速度、离心机转速、滤饼层的去除频率等,这些参数会影响到细胞的稳定性、处理的时间以及抗体收率等。可用通过优化这些参数合理地使各种诉求达到平衡。

图2  Disk-stack离心机结构(courtesyofWestfaliaInc.)

(1)进料,(2)排出口(轻相),(3)向心泵,(4)碟片,(5)储渣空间,(6)排渣口,(7)排渣活塞阀,(8)离心捕集器,(9)排出口(重相),(10)喷嘴,(11)计量注水/开启水,(12)定时器.

切向流过滤

切向流过滤也和离心一样被广泛应用于细胞上清的收集。切向流过滤的优势在于一步就可以得到无颗粒的细胞上清,不需要额外的过滤步骤。但是在滤膜表明形成的浓缩极化层会严重影响膜的处理量,成为切向流过滤的一个主要问题。此外,由颗粒引起的不可逆的膜堵塞会降低膜的使用寿命,成为另一个主要的问题。目前有很多关于削弱浓缩极化层的研究,比如利用转动膜板来增大膜表面附近的流速,从而将浓缩极化层洗掉,还有一种方法是利用周期性地反冲洗来洗掉极化层。

对于切向流过滤系统而言,通量和收率是两个必须要考虑的重要因素。通量决定着处理细胞发酵液所需要的膜面积,具有重要的经济意义。通量过高会加快膜的堵塞,降低膜的寿命,所以通量的优化非常重要。膜的化学性质和孔径对于通量和可清洗能力也具有非常重要的决定性作用。此外,膜的载量即单位膜面积所处理的发酵液体积也是一个很重要的参数,需要深入优化,膜的载量优化对工艺的放大具有非常重要的意义。

深层过滤

深层过滤指的是利用多孔介质从流动相中截留固体颗粒而不是表面截留,且一般介质表面都带有正电荷,可以通过静电吸附的方式来拦截杂质颗粒。原理如图 3 所示。当流体中颗粒较多时往往使用深层过滤。深层过滤介质一般由纤维素或聚丙烯纤维柱床、过滤介质(如硅藻土)和粘合剂(用于制作平整的界面)组成。由于离心不能完全去除细胞及其碎片,而切向流成本太高,所以深层过滤通常被用于离心之后,也可以单独用于细胞发酵液的澄清。由于深层过滤介质的孔径并不均一,所以在深层过滤之后会紧接一个除菌过滤工艺,以利于色谱柱的纯化。

图3  深层过滤介质的过滤机理

深层过滤工艺的开发首先需要选择过滤介质,介质的化学性质、孔径、荷电性质是需要重点考虑的因素。在选择介质的过程中,滤出液的浊度和过滤后介质压力差的升高将作为两个重要的参数。另外一个选择介质的重要参数则是深层过滤之后再用除菌过滤的压力差变化。3M的深层过滤产品如图4所示,能提供从实验室小试、中试及大规模生产所需的不同尺寸的产品。

 

图4 适用于不同规模的一体式深层过滤产品

对于细胞发酵液的澄清工艺,3M推荐的方案分别为单级深层过滤和双级深层过滤两种模式,可完全取代离心步骤,滤出液浊度小于10NTU,通量一般在100L/M2以上。具体选型方案如下图5所示。

图5 细胞发酵液澄清工艺

此外,3M还具有带强电荷的ZB系列产品,可应用于对DNA或HCP的去除有特定需求的澄清工艺。

絮凝作用

絮凝作用通过多种途径是发酵液中的小颗粒变为大颗粒从而增强后续的过滤效果。絮凝剂通过吸附小颗粒形成大颗粒,减少了堵塞膜孔的小颗粒,同时降低了颗粒的可压缩性,从而减小了滤饼层的过滤阻力。常用的絮凝剂有硅藻土和珍珠岩。但是向发酵液中加入这些土质的材料,对于原核表达的产品可能没有问题,但是对于干净的真核发酵液来说,可能有应用局限性。所以用深层过滤的方式固定这些材料常被用来澄清发酵液。

总结

合适的细胞去除和澄清的工艺单元取决于生产规模以及工艺设施。大规模工艺的发展使得细胞去除和澄清工艺中蛋白的收率达到98%以上。目前,离心已经成为广受青睐的细胞去除方式(大于2000L的规模),Disk-stack离心容易清洁而且比很多大型的切向流

装置容易做无菌处理。但离心装置的使用必然会需要发酵液的二次澄清过程,另外,需要提供相关的验证资料,维护成本也相对较高。深层过滤由于其工艺更容易放大,成本更低,处理周期短,且一次性深层过滤工艺由于其操作更加灵活、简便,现以被越来越多地生物制药客户所接受。


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