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揭示细胞检测烷基化DNA损伤机制——为肿瘤治疗提出新方案

揭示细胞检测烷基化DNA损伤机制——为肿瘤治疗提出新方案

闪耀阿猫 2018-05-10

美国华盛顿大学圣路易斯医学院的Cynthia Wolberger & Nima Mosammaparast报道他们发现人体细胞对DNA烷基化损伤的应答的新方式。相关研究结果于2017年11月8日在线发表在Nature期刊上

1、 U2OS细胞用甲基磺酸甲酯处理后,ASCC3会在核内局部聚集形成focifigure 1a,免疫荧光),但是ASCC3 knockout后则无此现象,且其他类型的DNA损伤则不会造成此影响。(figure 1a b)说明ASCC3与甲基化损伤有关。

2、 为了证明ASCC复合体被招募到核内烷基化损伤的部位,作者用了邻位连接技术(figure 1c),发现甲基磺酸甲酯损伤后,甲基化的腺嘌呤和ASCC3间产生了特异的PLA信号。

3、 免疫荧光显示烷基化损伤时,ASCC复合体与BRR2(解旋酶)PRP8splicing),RNA聚合酶II存在共定位。

4、 ASCC II的序列进行分析发现,ASCC II上存在一个从属于泛素结合结构域超家族的CUE结构域。(figure 2a)另外,作者又对CUE结构域进行核磁共振成像,并与一个已知的泛素识别蛋白Vps9上的CUE结构域进行比较,(figure 2b),已知vps9CUE结构域结合泛素二聚体,作者通过结构推测ASCC2以单体的形式结合泛素。

5、 用组氨酸标签连接ASCC2后做western blot 发现,ASCC2识别的是组蛋白K63的泛素基团而不是K48。(figure 2c

6、 接着作者对ASCC2 CUE结构域设计突变,用等温滴定量热法发现,L506A突变的ASCC2不能结合泛素基团,(figure 2d)而且免疫荧光也发现,突变的ASCC2导致甲基化损伤后的ASCC foci的减少。(figure 2e

7、 作者认为ASCC2起到招募ASCC-ALKBH3复合体其他组分的作用,为了验证这一点,作者用crisper-cas9敲除了ASCC2基因,免疫荧光发现甲基化损伤后,ASCC3 foci显著减少(figure 3ab),而且ALKBH3ALKBH2 foci也消失。(figure 3c)另外,动力学分析表明,在基因敲除的细胞中,DNA烷基化的修复过程也变慢。(figure 3d

8、 接下来,作者又向基因敲除的细胞中引入正常和突变的ASCC2蛋白,发现引入正常ASCC2的细胞重新出现甲基化损伤导致的ASCC3 ALKBH3 foci.

9、 综上作者推断ASCC2可以与ASCC3K63泛素侧链结合,并进一步招募ALKBH3

10、           接下来作者又对泛素化的过程进行了研究。已有研究表明UBC13作为E2泛素结合酶参与DNA损伤修复过程,作者敲除UBC13后发现ASCC2 foci减少。然而敲除两种E3泛素连接酶RNF8RNF168ASCC2foci的形成却不受影响,说明存在一种独特的泛素连接酶。为了确定这种泛素连接酶,作者用一些shRNA靶向那些与UBC13有相互作用的以及研究表明与DNA修复有关的E3泛素连接酶,找到了RNF113A.进一步实验验证发现,shRNA会降低RNF113A蛋白水平和ASCC2foci的形成。

11、           为了研究RNF113A的功能特征,作者通过对K63突变的组蛋白进行研究,发现泛素化基团不能延长,说明RNF113A可能能增强UBC13的活性。另外,RNF113突变的细胞中,ASCC3 foci的形成也显著减少。

12、           接着,作者在蛋白质组学方面研究与ASCC2有相互作用的蛋白。其中,BRR2RNF113AASCC复合体存在共定位。BRR2RNF113A免疫共沉淀分析表明RNF113A 的氨基端结构域是结合BRR2的关键部位。

 

总结:DNA嘌呤上的烷基化损伤导致了UBC13RNF113A对组蛋白K63的多聚泛素化修饰,之后ASCC2被招募,ASCC2 CUE domain与泛素基团结合,进一步招募去烷基化酶ALKBH3ASCC3,以及解旋酶BRR2,对烷基化损伤进行修复。但是,文章没有解决的问题是烷基化损伤为什么会特异性地激活RNF113A而不是其他的泛素连接酶。


参考文献:

Brickner J R, Soll J M, Lombardi P M, et al. A ubiquitin-dependent signalling axis specific for ALKBH-mediated DNA dealkylation repair.[J]. Nature, 2017, 551(7680):389-393.


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