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老药新用-肿瘤潜在药物发现

老药新用-肿瘤潜在药物发现

2018-6-28 闪耀阿猫

 2017年12月14日发表在NATURE文中报道了双硫仑在体内代谢生成二硫代氨基甲酸酯与其他代谢产物,其中一些能抑制肝脏乙醛脱氢酶。

       作者先通过流行病学分析发现双硫仑与肿瘤死亡率下降有相关性,之后又证明了双硫仑在体内代谢,并与铜离子生成代谢物CuET,在肿瘤组织中聚集,

 

一、 流行病学分析

作者收集了三类第一次患肿瘤病人的信息:1、肿瘤发病前五年内接受过双硫仑治疗,但是发病后一年未服用双硫仑(previous users);2、肿瘤发病前五年内接受过双硫仑治疗,且发病后一年也在服用双硫仑(continue users);3、肿瘤发病前后均未服用过双硫仑(never users)。之后作者计算了肿瘤死亡率与双硫仑使用的风险比,发现,在不同类型、不同时期的肿瘤中,previous users的死亡率比never users高,但continue users的死亡率则降低。这说明了双硫仑具有抗肿瘤的作用。


二、 DTC-copper复合物发挥抗癌作用

①    之前研究发现双硫仑抗癌活性是铜离子依赖的,为了证明这一说法,作者设计了如下实验:将人乳腺癌细胞接种到小鼠皮下,将小鼠分为四组,分别饲喂一下四种食物:1、正常食物;2、正常食物加葡萄糖酸铜;3、正常食物加双硫仑;4、正常食物加双硫仑和葡萄糖酸铜。之后检测肿瘤大小随时间的变化。通过实验作者发现,与control组对比,葡糖糖酸铜组肿瘤大小没有差异,而双硫仑组和双硫仑+葡萄糖酸铜组肿瘤大小分别下降了57%和77%,这说明了双硫仑具有抗肿瘤的作用,而铜离子可以加强它的活性。


②    那铜离子是怎样起到加强作用的呢?通过对双硫仑代谢过程的研究,作者猜测,双硫仑分子在体内代谢生成两个二乙基二硫代氨基甲酸酯分子(DTC),而铜离子可以连接硫原子形成四个共价键,从而生成二乙基二硫代氨基甲酸铜(CuET),而CuET是发挥抗癌作用的产物。为了验证这一假设,作者用高效液相色谱分析小鼠肝脏、大脑、血清和肿瘤组织中的CuET浓度,发现双硫仑+铜离子组与双硫仑组相比,肝脏、大脑、血清中的CuET浓度略有升高,而肿瘤组织中的CuET浓度则显著升高,证明了CuET会在肿瘤组织中聚集并发挥作用。并且,作者在服用了双硫仑的病人的血浆中也发现了CuET的生成。

③    接着,作者人为地合成了CuET,并进行了细胞和动物实验。细胞实验发现,用CuET培养的人乳腺癌细胞活性比DTC培养的显著降低。动物实验发现,使用CuET的治疗组比对照组的肿瘤大小显著减小,生存率显著提高。这些都证明了CuET的抗肿瘤作用。

三、 CuET抑制p97依赖的蛋白降解过程

①    之前有研究认为双硫仑通过影响蛋白降解发挥抗癌作用,于是作者对CuET与蛋白讲解之间的关系进行了研究。作者通过实验发现,CuET会导致多聚泛素化蛋白的积聚,且会抑制肿瘤细胞中TNFα介导的IκBα降解过程,这点是和蛋白酶体抑制剂BTZ的作用是相同的。另外,随着CuET剂量的增加,一种泛素融合降解底物Ub-GFP的降解率也会降低。 但是呢,又有一些实验证据表明,CuET是不会影响所有蛋白酶体功能的,于是作者认为CuET在蛋白酶体的上游即发挥了作用。

②    接着作者就把焦点放在了蛋白酶体上游的p97依赖的蛋白降解过程上。缺氧诱导因子HIF-1α在正常情况下很快会被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶体途径降解,只有在缺氧条件下才可以稳定表达,作者发现,当使用蛋白酶体抑制剂如BTZ或MG132后,HIF-1α会明显增加,而敲除p97或使用CuET后仅会少量增加,这似乎预示了CuET对p97的抑制作用。为了进一步证明该作用,作者又做了两项实验——第一个实验是:先用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,之后洗脱,加入蛋白翻译的抑制剂,并分别加入蛋白酶体抑制剂BTZ,CuET和p97 ATP酶抑制剂DBeQ,之后作者观察了HIF-1α和p97的靶蛋白CDC25A的含量变化,发现以上三种抑制剂都会抑制CDC25A的降解,但是只有蛋白酶体抑制剂BTZ才能抑制HIF-1α的降解。第二个实验是:已知一个分子量为120kDa的蛋白NRF1,会在p97参与下切割成110kDa的产物,之后被蛋白酶体降解,作者通过western发现,经过CuET和p97抑制剂处理后,仅有120kDa的蛋白积聚,而经过蛋白酶体抑制剂处理,既有120kDa的蛋白积聚,也有110kDa的蛋白积聚。这些结果都证明了CuET是通过影响p97 pathway发挥作用。

四、 CuET结合并固定NPL4

①    那CuET是如何抑制p97 pathway的呢?p97有两个关键的协同因子——NPL4和UFD1,作者通过过量表达p97、NPL4和UFD1,发现在经CuET处理后,只有过量表达NPL4才会挽救肿瘤细胞的生存能力,这说明NPL4可能是CuET的靶点。活细胞成像发现,经过CuET处理后,NPL4会在核内聚集,而UFD1和p97则不会。荧光漂白恢复技术发现,在2-3h内,大部分NPL4都会固定在核内以及细胞质的一些区域。作者将能用去垢剂提取出来的蛋白和不能用去垢剂提取出来细胞蛋白进行western blot验证,发现NPL4主要存在于不能提取出的组分中,说明NPL4经CuET处理后被固定了。

②    已知NPL4有两个锌指结构,其中一个在C端。锌指结构被认为可以结合二价金属离子,因此作者认为NPL4是通过锌指结构与CuET相互作用的。但是等温量热分析发现,CuET与NPL4只有一个结合位点,那哪个锌指结构才是结合的位点呢?首先作者发现人体细胞中本身便存在一种没有C端锌指结构的NPL4蛋白亚型。另外,通过设计突变发现,只有非C端的锌指结构发生突变时,NPL4与CuET的下相互作用才会消失。这说明非C端的锌指结构是NPL4与CuET相互作用所必需的。同时作者也发现了一个有趣的现象,突变后的NPL4在不需要CuET处理时也会自发地在核内固定成簇,但是过量表达这种突变的NPL4并不会提高细胞对CuET的抵抗能力,甚至对细胞是有毒害作用的。

五、 NPL4聚集引起热休克反应

①    作者发现,无论是核内聚集还是胞质中固定对的NPL4都与多聚泛素化、SUMO化的蛋白以及TDP43蛋白存在共定位,说明NPL4会和缺陷蛋白聚集。那么NPL4是通过什么机制与缺陷蛋白聚集的呢?作者用E1泛素激活酶抑制剂阻断细胞的泛素化过程,但是发现NPL4仍然能够聚集和固定,这说明NPL4不是通过识别泛素化或SUMO化的蛋白而聚集的,那么就是固定了的NPL4可以招募已经或即将泛素化或SUMO化的蛋白。

②    那么NPL4是通过什么机制固定的呢?已知一种与细胞内蛋白聚集的关键分子是HSP70,通过对HSP70进行研究,发现它与CuET导致的NPL4聚集点或者突变的NPL4自发形成的聚集点都存在共定位,而这些聚集点同时与p97存在共定位。并且这些聚集点中的p97的免疫反应活性与标记NPL4的GFP信号强度有相关性,说明p97通过与NPL4结合而被固定。而另一种与NPL4结合的蛋白UFD1,却不能在不能溶于去垢剂的样本中找到,说明UFD1不能与NPL4-p97复合体结合或者结合的很微弱。

③    已知错误折叠或者损伤的蛋白会通过热休克因子HSF1触发细胞的热休克反应,作者认为CuET会与HSF1共同导致一种稳定的热休克反应,而这种热休克反应的标志,比如热休克蛋白的聚集、HSF1磷酸化水平的增加,都可以通过western blot观察到。

 

 

概括来说,这篇文章证明了传统治疗酗酒的药物双硫仑,可以在体内代谢产生CuET,在肿瘤组织中聚集,进入细胞后,CuET与NPL4结合并使其聚集,从而抑制了p97-NPL4-UFD1 pathway,使大量错误折叠或损伤的蛋白不能被分解,并引起热休克反应,最终导致了细胞死亡。

 

 



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